외부 시퀀싱 업체에서 long read 기반의 미생물 유전체 해독을 의뢰하는 경우 대부분 de novo assembly를 하여 완성 수준의 contig 서열을 만들어 제공하게 된다. 그러나 raw data를 직접 다루거나 자체적으로 조립을 실시하여 여러 가지 측면에서 평가를 하는 것이 중요할 때가 있다. Canu 또는 SPAdes와 같이 널리 쓰이는 assembler는 short/long read data의 단독 조립 및 hybrid assembly 기능도 제공한다. 호주 멜버른 대학에서 제공하는 Long read assembly workshop의 자료를 검토해 보는 것도 본 과정을 이해하는데 도움이 될 것이다.

시퀀싱 업체에서 제공하는 zip 파일의 압축을 풀면 각 SMRT cell마다 생성되는 디렉토리 하위에 Analysis_Results라는 서브디렉토리가 보일 것이다. 그 내부로 들어가면 각각 세 개씩의 subreads.fasta/subreads.fastq/bax.h5와 하나의 bas.h5 파일이 존재한다. Bas.h5/bax.h5 파일은 PacBio RSII 장비의 primary analysis pipeline을 거쳐서 만들어지는 주된 출력물이다(bas.h5 Reference Guide). 이들 HDF5 파일은 SMRT Analysis 또는 SMRT Link 프로그램을 설치하여 PacBio data의 de novo assembly나 resequencing analysis를 실시할 목적이 아니라면 직접 이용할 일은 많지 않다.

외부에서 입수한 PacBio raw data에는 일반 연구자에게 친숙한 fasta/fastq 파일이 없이 HDF5 파일만 들어있는 경우가 있다. 이러한 상황에서는 pbh5tools에서 제공하는 bash5tools.py(사용법)을 사용하여 필터링을 거친 read를 추출할 수 있다. bash5tools.py는 시스템에 설치된 python 환경에 존재한다. --readType으로 선택할 수 있는 것은 ccs, subreads 및 unrolled이다.

$ cd Analysis_Results
$ bash5tools.py *bas.h5 --outFilePrefix myreads --outType fasta --readType subreads --minReadScore 0.75