이 페이지는 Oxford Nanopore Technologies(ONT)의 sequencing 응용도 포함할 수 있도록 개편되어야 한다. 즉, long read, single molecule 기반의 염기서열 해독을 전부 망라하도록 한다.

• (리뷰 논문) PacBio sequencing and its application (2015) 링크
• PacBio blog
• PacBio Analytical software - SMRT analysis includes SMRT portal, SMRT analysis APIs, and SMRT view. 응용 분야
• PacBio SMRT analysis wiki
• PacBio bioinformatics training wiki

A Swiss-army knife for interrogating PacBio HDF5 files (cmp.h5, bas.h5)

• https://github.com/PacificBiosciences/pbh5tools
• https://github.com/PacificBiosciences/pbh5tools/blob/master/doc/index.rst (사용법)

• bash5tools.py can extract read sequences and quality values for both Raw and circular consensus sequencing (CCS) readtypes and use create fastq and fasta files.
• cmph5tools.py는 PacBio Alignment File Format(cmp.h5, 링크) 파일을 다루는 도구라는데 나는 아질 쓸 일이 없다.

–readType은 ccs, subreads, unrolled. ccs는 bas.h5 파일 내부에 ccs read가 있는 경우에 뽑아낸다. unrolled는 어떤 것인지 잘 모르겠다. 이것이 바로 raw read 그대로를 의미하는 것일까?

$ bash5tools.py input.bas.h5 --outFilePrefix myreads --outType fasta --readType subreads --minReadScore 0.75

Analysis Results 서브디렉토리에 있는 p0.[1-3].subreads.fast{a|q} 파일의 수치와 bash5tools.py를 이용해서 bas.h5 파일로부터 추출한 read의 수치를 비교해 보았다.

1. subreads.fastq: 1339659706 bp / 124615 seqs; 10750.4 average length
2. bash5tools.py (–readType unrolled): 1395878244 bp / 101548 seqs; 13746.0 average length
3. bash5tools.py (–readType subreads)
4. bash5tools.py (–readType subreads –minReadScore 0.7)
5. bash5tools.py (–readType subreads –minReadScore 0.75)
6. bash5tools.py (–readType subreads –minReadScore 0.8)
7. bash5tools.py (–readType subreads –minReadScore 0.85)
8. bash5tools.py (–readType subreads –minReadScore 0.9)
9. bash5tools.py (–readType subreads –minReadScore 0.95)

• SMRT analysis system requirements PDF 문서
• v2.3.0 installation guide PDF 문서

공식 documentation

$ canu -p BRC5 -d canu_BRC5-3cells_2nd genomeSize=3.7m useGrid=false -pacbio-raw BRC5_raw/BRC5-3cells_raw.fasta

gnuplot과 관련한 에러가 나면 다음의 메시지를 참고한다. 명령행에서 'gnuplot'을 입력하여 아무런 오류 없이 잘 실행이 된다면 상관이 없다.

ERROR:  Failed to run gnuplot from 'gnuplot'.ERROR:  Set option gnuplot=<path-to-gnuplot> or gnuplotTested=true to skip this test and not generate plots.

진짜 raw data를 그대로 쓸 것인가, 아니면 SMRT portal에서 filtered read를 회수하여 쓸 것인가?

• (논문) Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads (2017) PMC
• GitHub Quick usage

Unicycler는 매우 최근에 공개된 short-read-first hybrid assembler이다. GFA 형식의 assembly graph는 같은 개발자가 2015년에 발표한 Bandage(PubMed GitHub Documentation)으로 시각화하면 좋다. Circlator와 같은 외부 tool 없이도 circularization을 해 준다.

Bioconda(py35 environment)로 /data/anaconda2에 설치하였다.

$ unicycler -t 24 -1 MA-KW_1.fastq -2 MA-KW_2.fastq -l MA-KW_pacbio.fastq -o unicycler_run_20180518_1

이전 실행에서 이미 교정한 read를 사용하여 재조립을 한다면 다음과 같이 실행하여 시간을 줄일 수 있을 것이다.

$ unicycler -t 24 -l CorrectedReads_1.fastq.gz -2 CorrectedReads_2.fastq.gz -s unparedShortReads.fastq --no_correct -l longreads.gz -o outDirectory