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--- transcriptome_analysis [2017/04/05 08:18] – [CLC Genomics Workbench] hyjeong
+++ transcriptome_analysis [2021/03/17 13:09] (current) – external edit 127.0.0.1
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 RNA-seq을 이용한 진핵 생물의 전사체(transcriptome) 분석에서는 TopHat-Cufflioks-Cuffmerge-Cuffdiff-(CummeRbund)로 이어지는 [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3334321/figure/F2/|Tuxedo protocol]]이 표준으로 여겨지고 있다. 여기에서는 splicing을 고려한 read alignment, 새로운 유전자의 발견, novel splice variant의 발견 등이 관건이 된다. Cufflinks version 2.2.0부터는 Cuffquant/Cuffnorm이라는 새로운 프로그램을 포함하는 워크플로우로 바뀌었다([[http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/releases/v2.2.0/|링크]]).
-그러나 이 방법을 박테리아 대상의 RNA-seq data analysis에 그대로 적용하는 것은 무리가 있다. 특히 read alignment 과정이 박테리아에게는 딱 맞지 않는다. 왜냐하면 유전자 밀도가 낮은 진핵 생물과 달리 원핵 생물은 유전자 배열이 매우 촘촘하여 심지어는 서로 겹치기도 하고, splicing이 일어나지 않기 때문이다. 따라서 일반적인 (genome 유래) read mapping program을 그대로 사용하여 reference genome sequence에 붙이는 것이 더 나을 수 있다. 이러한 전체적인 과정은 2016년 발표된 한 논문("SPARTA: Simple Program Automated reference-based bacterial RNA-seq Transcriptome Analysis)의 [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4743240/figure/Fig1/|그림]]에 아주 잘 표현되어 있다.
+그러나 이 방법을 박테리아 대상의 RNA-seq data analysis에 그대로 적용하는 것은 무리가 있다. 특히 read alignment 과정이 박테리아에게는 딱 맞지 않는다. 왜냐하면 유전자 밀도가 낮은 진핵 생물과 달리 원핵 생물은 유전자 배열이 매우 촘촘하여 심지어는 서로 겹치기도 하고, splicing이 일어나지 않기 때문이다. 따라서 일반적인 (genome 유래) read mapping program을 그대로 사용하여 reference genome sequence에 붙이는 것이 더 나을 수 있다. 뿐만 아니라 세균의 경우 워낙 그 종류가 많아서 일부 모델 세균을 제외하면 표준적인 reference(annotation 정보 포함)가 없는 경우가 대다수이다. 즉, 분석을 하려는 당사자가 reference 정보를 같이
+ 준비해야 한다는 뜻이다. 이러한 전체적인 과정은 2016년 발표된 한 논문("SPARTA: Simple Program Automated reference-based bacterial RNA-seq Transcriptome Analysis)의 [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4743240/figure/Fig1/|그림]]에 아주 잘 표현되어 있다.
 아주 쉽게 이야기하자면 RNA-seq read의 mapping을 통해서 샘플로부터 다음 그림과 같은 형태의 데이터를 얻어내는 것이 첫번째 단계라고 할 수 있다. 각 셀을 채우는 수치는 특정 샘플(조건 및 반복)의 유전자가 갖는 expression value이다. 이것은 read count일 수도 있고, RPKM/FPKM 및 이에 상응하는 값일 수도 있다.
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 **추가 정보** CLC Genomics Workbench의 RNA-seq Analysis 옵션에 "Calculate RPKM for genes without transcript"가 있음을 발견하였다. 그렇다면 mRNA feature 없이 gene만 존재하여도 RPKM 계산이 가능함을 의미한다. --- //[[hyjeong@kribb.re.kr|Haeyoung Jeong]] 2017/02/23 11:42// 물론 이것은 prokaryote의 경우에 한한다.  --- //[[hyjeong@kribb.re.kr|Haeyoung Jeong]] 2017/04/04 16:33//
-**추가 정보** GFF3 file을 CLC에서 작업하는 경우 exon feature를 mRNA로 바꾸어야 나중에 제대로 track으로 표현된다.  --- //[[hyjeong@kribb.re.kr|Haeyoung Jeong]] 2017/04/04 16:33//
+**추가 정보** GFF3 file을 CLC에서 작업하는 경우 transcript feature를 mRNA로 바꾸어야 나중에 제대로 track으로 표현된다.  --- //[[hyjeong@kribb.re.kr|Haeyoung Jeong]] 2017/04/07 18:23//
 ==== .ptt & .rnt files ====
 과거에는 NCBI의 RefSeq 자료에 ptt/rnt 파일이 존재하였으나 이제는 더 이상 제공되지 않는다. 박테리아의 RNA-seq 데이터 분석용 프로그램인 [[http://ccb.jhu.edu/software/EDGE-pro/|EDGE-pro]]와 [[http://cs.wellesley.edu/~btjaden/Rockhopper/|Rockhopper2 ]]는 아직도 이것을 필요로 하므로, GenBank 파일을 사용하여 적당히 ptt/rnt 파일을 만들어야 한다.
 ==== GFF/GTF/GFF3 file ====
-GFF file은 워낙 형식이 느슨하므로 RNA-seq data analysis용 프로그램이 이를 잘 받아들이는지를 사전에 점검해야 한다. 예를 들어 Prokka annotation tool이 만들어낸 GFF3 파일은 뒷부분에 FASTA sequence가 붙어있는데, [[http://sparta.readthedocs.io/en/latest/|SPARTA]](htseq-count 단계)에서는 에러를 유발한다.
+GFF file은 워낙 형식이 느슨하므로 RNA-seq data analysis용 프로그램이 이를 잘 받아들이는지를 사전에 점검해야 한다. 예를 들어 Prokka annotation tool이 만들어낸 GFF3 파일은 뒷부분에 FASTA sequence가 붙어있는데, [[http://sparta.readthedocs.io/en/latest/|SPARTA]](htseq-count 단계)에서는 에러를 유발한다. 그러나 Ensembl에서 제공하는 GTF/GFF3 file은 특별한 조작을 가할 필요가 없다.
-=== CLC Genomics Workbench에서 이 파일을 사용하려면 ===
+=== CLC Genomics Workbench에서 이 파일을 사용하려면(non-Ensemble) ===
   - **Annotate with GFF file** 플러그인을 설치한다.
   - Sequence fasta file을 standard import로 불러들인다.