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--- scaffolding [2016/02/16 12:20] – [개요] hyjeong
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 ====== Mate-pair library read(Ion Torrent)를 이용한 scaffolding ======
 ===== 개요 =====
-Mate-pair library read는 일반적으로 Illumina platform에서 생성하게 되지만, Ion Torrent에서도 생산 가능하다. (rev, for) 방향의 paired file을 만들어내는 Illumina와는 달리 Ion Torrent에서는 라이브러리 구조상 하나의 read에 di-tag이 들어있게 되므로 ssf_extract(+ssha2)로 이를 분리해야 하고, 방향에도 유의해야 한다. 본 실습에서는 //Shigella boydii// ATCC 9210에서 SOLiD 5500 mate-pair library kit로 만든 3 kb 라이브러리 유래 read(SRA accession: SRX1585054)를 사용하였다.
+Mate-pair library read는 일반적으로 Illumina platform에서 생성하게 되지만, Ion Torrent에서도 생산 가능하다. (rev, for) 방향의 paired file을 만들어내는 Illumina와는 달리 Ion Torrent에서는 라이브러리 구조상 하나의 read에 di-tag이 들어있게 되므로 [[http://bioinf.comav.upv.es/downloads/sff_extract_0_3_0|sff_extract]](+[[https://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/|ssha2]])로 이를 분리해야 하고, 방향에도 유의해야 한다. 본 실습에서는 //Shigella boydii// ATCC 9210에서 SOLiD 5500 mate-pair library kit로 만든 3 kb 라이브러리 유래 read(SRA accession: SRX1585054)를 사용하였다.
-SSPACE는 최신 버전이 아니라 A5-miseq에 포함된 v1-1(2010년 11월 배포)을 사용한다.
+SSPACE([[http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/27/4/578.full|논문 링크]])는 [[http://www.baseclear.com/genomics/bioinformatics/basetools/SSPACE|최신 버전]]이 아니라 A5-miseq에 포함된 v1-1(2010년 11월 배포)을 사용한다.
   $ export PATH=$PATH:/usr/local/Bio/bowtie2-2.2.6
   $ export PATH=$PATH:/usr/local/Bio/a5_miseq_linux_20140604/bin
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   $ export PATH=$PATH:/usr/local/Bio/bin (for sff_extract, SolexaQA++, getinsertsize.py)
 ===== Di-tag의 분리 및 quality trimming =====
+(주의) sed 실행에서는 read의 서열 ID 실제 형태에 맞는 패턴을 주어야 한다.
+  $ sff_extract -l linkers.fasta -s SB_iontor.fastq SB_0628.sff
+  $ SolexaQA++ dynamictrim SB_iontor.fastq –-torrent (default: P = 0.05)
+  $ sed -n '/^@BYI6V.*\/1$/{N;N;N;p;}' SB_iontor.fastq.trimmed > SB-trimmed_1.fastq
+  $ sed -n '/^@BYI6V.*\/2$/{N;N;N;p;}' SB_iontor.fastq.trimmed > SB-trimmed_2.fastq
+  [optional] SolexaQA++ lengthsort SB-trimmed_1.fastq SB-trimmed_2.fastq -l 40
+==== linkers.fasta ====
+  >IA
+  CTGCTGTACCGTACATCCGCCTTGGCCGTACAGCAG
+  >IA_revcom
+  CTGCTGTACGGCCAAGGCGGATGTACGGTACAGCAG
 ===== (optional) Reference mapping을 통한 read 방향과 quality 확인 =====
+  $ bowtie2-build SB_clc.fa SB
+  $ bowtie2 -x SB -2 SB-trimmed_1.fastq -1 SB-trimmed_2.fastq --ff -I 800 -X 5000 -S tmp.sam
+  $ samtools view -b -S -o tmp.bam tmp.sam
+  $ samtools view tmp.bam | getinsertsize.py -
+===== SSPACE를 이용한 scaffolding =====
+A5-miseq에 포함된 구 버전의 SSPAE(v1-1)는 paired end(-> <-, 0)와 mate-pair(<- ->, 1)만을 지원하므로, Ion Torrent에서 만들어진 mate-pair library read(RR, <- <-)를 사용하기 위해서는 read file 중 하나를 reverse complementary로 전환해야 한다. 또한 라이브러리 정보 파일의 형식도 다르다.
+  $ seqtk seq -r SB-trimmed_1.fastq > 1rc.fastq
+  $ seqtk seq -r SB-trimmed_2.fastq > 2rc.fastq
+  $ path-to-SSPACE/SSPACE -l library.txt -s SB_clc.fa -k 5 -a 0.7 -x 1 -b SB_SSPACE_ext
+  $ cat SB_SSPACE_ext.summaryfile.txt
+==== SSPACE v1-1의 library file ====
+library.txt와 library2.txt 중 하나를 선택하여 사용하면 됨
+  $ cat library.txt
+  PGM_mate-pair-library SB-trimmed_1.fastq 2rc.fastq 3000 0.5 1
+  $cat library2.txt
+  PGM_mate-pair-library 1rc.fastq SB-trimmed_2.fastq 3000 0.5 0
+==== SSPACE v3.0의 library file 사례====
+  Lib1 bwa file1.1.fasta file1.2.fasta 400 0.25 FR
+  Lib1 bowtie file2.1.fasta file2.2.fasta 400 0.25 FR
+  Lib2 bwasw file3.1.fastq file3.2.fastq 4000 0.5 RF
+  Lib2 TAB file4.tab 4000 0.5 RF
+  Lib3 TAB file5.tab 10000 0.5 RF
+  unpaired bowtie unpaired_reads1.fasta
+  unpaired bwasw unpaired_longreads1.gz