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--- bioinfo:참조_서열에_대한_매핑_reference_mapping_및_시각화 [2023/06/21 15:04] – [SRA data를 다운로드하는 방법(상세)] hyjeong
+++ bioinfo:참조_서열에_대한_매핑_reference_mapping_및_시각화 [2024/07/05 10:04] (current) – [Mapping의 실제] hyjeong
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 ===== Mapping의 실제 =====
-샘플로 사용할 Illumina sequencing read는 [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1021861|SRX1021661]]의 단일 run 결과(SRR2014531)로부터 2백만 read(2 x 101 nt cycle)이며, read mapper로는 bowtie2를 사용한다. Bowtie2에는 paired read의 간격이나 방향 설정 등 입출력물의 형식 및 정렬 조건에 대한 다양한 옵션을 줄 수 있는데, 여기에서는 일루미나 paired end read에 해당하는 기본 조건(forward-reverse, no distance constraint)으로 하였다. Alignment의 기본 조건은 --end-to-end인데, 트리밍을 하지 않은 read라면 --local이 더 나을 수도 있다. 파라미터의 조합에 따라서 speed/sensitivity/accuracy이 달라지므로 자세한 사항은 [[https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml|bowtie2 매뉴얼]] 혹은 [[https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#getting-started-with-bowtie-2-lambda-phage-example|'Getting started' 섹션]]을 참조하라.
+샘플로 사용할 Illumina sequencing read는 //E. coli// BL21(TaKaRa)에서 유래한 [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1021861|SRX1021661]]의 단일 run 결과(SRR2014531)로부터 2백만 read(2 x 101 nt cycle)만을 추출한 것이며, read mapper로는 bowtie2를 사용한다. Bowtie2에는 paired read의 간격이나 방향 설정 등 입출력물의 형식 및 정렬 조건에 대한 다양한 옵션을 줄 수 있는데, 여기에서는 일루미나 paired end read에 해당하는 기본 조건(forward-reverse, no distance constraint)으로 하였다. Alignment의 기본 조건은 --end-to-end인데, 트리밍을 하지 않은 read라면 --local이 더 나을 수도 있다. 파라미터의 조합에 따라서 speed/sensitivity/accuracy이 달라지므로 자세한 사항은 [[https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml|bowtie2 매뉴얼]] 혹은 [[https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#getting-started-with-bowtie-2-lambda-phage-example|'Getting started' 섹션]]을 참조하라.
   # 실습용 raw data의 설명은 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR2014531 참조
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   $ samtools view -b -S -o BL21.bam BL21.sam
-SAM 파일의 대부분을 구성하는 read alignment 필드에서 두 번째 필드(flag, 0-255 범위의 숫자)는 read의 mapping 상태를 비트 단위로 나타낸다. 특정 flag를 만족하는 alignment를 추출하려면 samtools view -f INT를, 만족하지 않는 것을 추출하려면 samtools -view -F INT 명령을 사용하면 된다. Reference에 반복 서열이 존재하면 하나의 read가 여러 곳에 붙어서 각각 별도의 alignment를 생성하게 되므로(primary vs. secondary alignment), mapped read의 수치와 관련된 작업을 하려면 주의가 필요하다. 뿐만 아니라 chimeric alignment인 경우에도 하나의 read가 representative 및 supplementary alignment로 여러 차례 나타날 수 있다. SAM flags를 해독하려면 ‘samtools flags 4’와 같이 입력하거나 Decoding SAM flags 웹사이트를 이용하라. 예를 들어 0x04는 segment unmmaped를 의미한다. ‘0x’는 16진수임을 명시하기 위한 것이다(예: 10 = 0xa). [[https://gist.github.com/jvhaarst/9643139|getinsersize.py]]는 매핑 데이터를 분석하여 라이브러리 크기에 대한 정보를 제공한다.
+SAM 파일의 대부분을 구성하는 read alignment 필드에서 두 번째 필드(flag, 0-255 범위의 숫자)는 read의 mapping 상태를 비트 단위로 나타낸다. 특정 flag를 만족하는 alignment를 추출하려면 samtools view -f INT를, 만족하지 않는 것을 추출하려면 samtools -view -F INT 명령을 사용하면 된다. Reference에 반복 서열이 존재하면 하나의 read가 여러 곳에 붙어서 각각 별도의 alignment를 생성하게 되므로(primary vs. secondary alignment), mapped read의 수치와 관련된 작업을 하려면 주의가 필요하다. 뿐만 아니라 chimeric alignment인 경우에도 하나의 read가 representative 및 supplementary alignment로 여러 차례 나타날 수 있다. SAM flags를 해독하려면 ‘samtools flags 4’와 같이 입력하거나 Decoding SAM flags 웹사이트를 이용하라. 예를 들어 0x04는 segment unmmaped를 의미한다. ‘0x’는 16진수임을 명시하기 위한 것이다(예: 10 = 0xa). [[https://gist.github.com/jvhaarst/9643139|getinsersize.py]]는 매핑 데이터를 분석하여 라이브러리 크기에 대한 정보를 제공한다. 이 스크립트에 대한 상세한 설명은 [[https://allaboutbioinfo.blogspot.com/2012/04/estimating-paired-end-read-insert.html|Estimating paired-end read insert length from SAM/BAM files]]를 참조하라.
   $ samtools flagstat BL21.bam
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 SRA의 Run Browser에서 Data access 탭을 선택한 다음 URL을 클릭하여 직접 다운로드를 할 수도 있다. 아래 그림처럼 NCBI Location 오른쪽의 [[https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR8981517|URL]]을 클릭하면 SRR8981517라는 파일을 받게 된다.
+{{  :bioinfo:sra_data_access.png?400  |}}
+이를 ~/ncbi/public/sra/SRR8981517.sra라는 이름으로 저장한 뒤 다음 명령어를 써서 fastq-dump를 실행한다.
+  $ fastq-dump --split-files SRR8981517
+  Read 1431064 spots for SRR8981517
+  Written 1431064 spots for SRR8981517
+사실은 앞서 설명했듯이 ‘fastq-dump %%--%%split-files SRR8981517’라고만 입력하여 실행을 해도 .sra 파일 다운로드와 fastq 추출 작업이 자동으로 연이어서 진행된다.